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徕卡超高分bian显微技术-病毒学xiangguanyan究应用
点ji次数:5439 发布日期:2020-10-9  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则ze任自fu
引言
2020nian注定是buping凡de一nian,也jiang是载入史册de一nian。一个bu太热门deyan究,一下子进入了公众视野,给我们上了一tang沉重de课。那么ruhe有xiao防范病毒传bo,ruhe进行专业防控和yi苗yan发,zhedu需要对病毒基本特征和机理深入yan究。
 
ran而,由yu受daoguang学yanshe极xiandexian制,普通guang学显微镜分bian率只能达dao200nm,而通常病毒和ya细胞结构de尺寸只有几十dao200多纳mi,远远小yu普通guang镜de分bian率。超高分bian显微技术de出现,为观测zhelei精细结构ti供羢i赡埽虼艘驳胐ao了越来詊iao惴篸e应用。作为超高分bian技术de先驱,受激发she损耗(STimulated Emission Depletion, STED)技术更是在生命科学领域尤其是病毒学xiangguanyan究中发挥着重要作用。
 
本次为dajia分xiangSTED技术在病毒学yan究中de应用和新进展,助力生命科学yan究和发展。
 
STED基本原理
2014nian诺贝尔化学jiang授予三位科学jia,以表彰他们发明超高分bian显微技术。其中Stefan Hell发明了STED技术,而徕卡公司也是第一个jiang其商业化。从2007niankaishi,徕卡STEDchan品bu断创新和优化,yi经拥有jin13niandeSTED技术积累。2014nianshou次tui出SP8 STED 3X,即荣获当niandeR&D100dajiang。2019nian更是创新性detui出了τ-STED,进一步在ti升分bian率de同时降低了激guang功率,更适合活细胞超高分bian成像。
2014nian诺贝尔化学jiang获得者,zuoqi分别是:Eric Betzig、Stefan W. Hell、William E. Moerner

说了zhe么多,STED技术原理dao底是什么呢?很简单。我们想象一下,一个点发she出de荧guang信hao,被jian测hou通常是一个yanshe斑;ru果我们同时shi用一个甜甜quan样de激guangjiang其周围de信hao擦除掉,只yunxu中心很小de荧guang信hao发she出来,zhe样分bian率bu就ti高了ma。zhe个qi擦除作用de激guang便是STED激guang,也叫损耗guang,利用de是荧guangde受激发she损耗原理。之hou,通guo对图像desao描,即可直接呈现超高分bian图像,无需任hehou续计算guo程。同时,gen据公shi,可通guozeng加STED激guang功率来ti升图像分bian率。
STED原理示意图:STED通guo受激发she损耗去除yanshe环上de荧guang信hao,dada缩小有xiaode激发区域,从而gai写了分bian聅hi玸hi,ti高了guang学分bian率
 

STED技术在病毒学yan究中de应用实例
 
01
第一个应用实例,是对病毒精细结构de观察。2012nian发表在guo际顶级期刊science上,标题为:荧guang纳mi显微镜(STED)揭示成熟依赖deHIV-1病毒表面蛋白de再分布特征【1】


图中绿色代表HIV-1病毒粒子,红色表示病毒表面demo蛋白。可以看dao,通guo普通共聚jiao无法分bianmo蛋白de具体定位位zhi,很模糊。包mo糖蛋白gp120(红色)yu病毒粒子(绿色)90%共定位,信hao模糊,分bianbu出细节。而STED成像可以发现,da多数成熟病毒粒子表现出单一de包mo蛋白Env信hao或jiao点(图1B),而da多数wei成熟粒子表现出liang个或liang个以上de包mo蛋白Env信hao(图1D)。
 
 
02
第二个应用实例,是对病毒成熟guo程de观察。标题为:STED纳mi显微綿ao沂綡IV病毒蛋白水解成熟de时间guo程【2】

利用STED显微镜发现在HIV-1病毒成熟和wei成熟条jian下,可非常清晰区分其Gag蛋白debu同结构特征。wei成熟病毒deGag蛋白呈中空环状(图a),而成熟病毒中呈实心固缩状(图b)。


作者巧miaode利用guang控方法,进行STED时间xu列成像。在400nm紫外guangzhaohou,PDI(guang催化絛ao鈊e蛋白酶襷hong萍粒┙dao猓珿ag蛋白能gou被蛋白酶水解切ge,进而病毒成熟。STED时间xu列成像可轻松捕获病毒从wei成熟dao成熟guo程,Gag蛋白重排de结构bian化guo程。

03
第三个应用实例,是对病毒基因组示踪。标题为:以单分子分bian率示踪宿主细胞中de病毒基因组【3】


腺病毒DNA通guoAF594标记de叠dan点jifan应蟳un荆驴堑鞍淄╣uo抗hexonde抗体识别,并且只有在脱壳hou,病毒DNA才可以被fan应jian测dao荧guang信hao。
 
通guogated STED超高分bian显微成像,可显zhuti高分bian率,清晰呈现病毒衣壳和DNAdezhen实尺寸da小。腺病毒衣壳实际da小yue80nm,gSTED蟳un緔ue110nm(包含一二抗尺寸),yu实际一致。gSTED蟳un颈灰驴堑鞍装黡e病毒DNA尺寸略小yu80nm,也yu衣壳尺寸符合。
 
04
第四个应用实例,是对病毒基因组复制de观察。标题为:利用STED超高分bian显微镜观察复制deHSV-1病毒【4】。值得一tide是,本文由中科院昆明动物所周巨民lao师课题组yu徕卡公司合作完成。

病毒基因组复制是单纯疱疹病毒 1 (HSV-1) 溶解感ran周期de重要shijian。目qian由yujian测和观察方法de局xian,病毒复制guo程de细节reng难以捕zhuo。为了获得更加详细de HSV-1 复制机制,本文shi用了STED受激发she损耗显微镜,结合荧guang原位杂交 (FISH) 和免yi荧guang,对HSV-1 复制guo程进行了精细观察。
 
作者she计了位yuHSV-1病毒基因组liangduande探针,分别以DIG(绿色)和Biotin(红色)进行标记,在病毒复制de早期和晚期,分别成像观察。STED成像发现,在复制de早期,红绿liang色信haode共定位程du较高;而在复制hou期,liang个系数均发生了明显降低,表明HSV-1 基因组在复制guo程中经历了从紧cudao松弛de动态结构bian化,同时需要zhan用较dade縵han浣懈粗啤
 
05
第五个应用实例,是对病毒侵ran和传boguo程捕获deyan究。标题为:ARP2和病毒诱导desi状wei足促进了人lei呼吸道合胞体病毒de传bo【5】

利用STED超高分bian显微綿ao谐上瘢⑾指衦an了RSV病毒de细胞(图A第一行,标记为A和C)外存在daliangdesi状wei足(红色),且富ji有daliang病毒ke粒(绿色);an示可通guosi状wei足jiangRSV病毒传递给邻jin细胞。而在ARP2敲除de细胞中(图A第二行),即便感ran了RSV病毒,细胞desi状wei足数liangdudaliang减少,病毒在细胞间de传bobu明显。fangda图像(图B),可观察daoRSV病毒主要分布在si状wei足de尖duan,进一步验zheng了病毒可通guo诱导si状wei足dechan生来促进其在细胞间de传bo。
 
ruhe进一步ti高STED分bian率?
gen据公shi我们可以知道,通guozeng加STED激guang功率就可直接zeng加图像de分bian率,zhe个方法最为简单;dan问题是bu利yu活细胞成像。那么ruhe在buti高激guang功率deqianti下,进一步ti高STED分bian率呢?有以下三zhong方法,分别是gated STED,gated STED + Lightning,和徕卡新tui出deτ-STED。
 
01
以liang个距li76nmdeDNA Origami为例,gated STED在bugaibianSTED激guang功率deqianti下,逐步缩小荧guang寿命dejian测范围,可逐步ti高分bian率,清晰地分bianliang个点信hao。


02
对中心粒degated STED + Lightning成像结果,分bian率(半高宽)可达22nm!


03
新一代STED:τ-STED,即jiangSTED和超快sude荧guang寿命xiang结合,实时呈现超高清分bian图像。它在yi有STED优势de基础上,可以更低激guang功率获得更高图像分bian率,进一步拓展荧guangran料de选择,非常适合长时间de活细胞成像。


结语
徕卡STED拥有13niandeyan发、技术和服务经验,也具有以下突出优势特点,是病毒学yan究de绝佳利器:
  • “纯guang学”超高分bian显微技术,所见即所得
  • 全guang谱、多色超高分bian成像,ti供592nm/660nm/775nm三gen STED谱线
  • 专为STEDshe计de多款满足bu同应用需求de物镜
  • shi用常规荧guangran料及荧guang蛋白,制样简单、穓iang
  • τ-STED低guang毒性,更适合活细胞超高分bian成像
  • 快susao描头能gou更好de保护样品
  • LAS X Navigator能gou轻松xun找目标视野
 
此外,zheng个STED是da载在徕卡共聚jiaoping台上de,因此也拥有共聚jiaode所有优点。xiang信徕卡STED超高分bian显微綿e躦ou更多地贡献超高清图像结果,助力病毒学和生命科学yan究发展。
 
参考文献:
【1】Chojnacki J, Staudt T, Glass B, et al. Maturation-dependent HIV-1 surface protein redistribution revealed by fluorescence nanoscopy.[J]. Science, 2012, 338(6106): 524-528.
【2】Hanne J, Gottfert F, Schimer J, et al. Stimulated Emission Depletion Nanoscopy Reveals Time-Course of Human Immunodeficiency Virus Proteolytic Maturation[J]. ACS Nano, 2016, 10(9): 8215-8222.
【3】Wang IH, Suomalainen M, Andriasyan V, et al. Tracking viral genomes in host cells at single-molecule resolution. Cell Host Microbe. 2013;14(4):468–480. 
【4】Li Z, Fang C, Su Y, et al. Visualizing the replicating HSV-1 virus using STED super-resolution microscopy[J]. Virology Journal, 2016, 13(1): 65-65.
【5】Mehedi M, Mccarty T, Martin S E, et al. Actin-Related Protein 2 (ARP2) and Virus-Induced Filopodia Facilitate Human Respiratory Syncytial Virus Spread[J]. PLOS Pathogens, 2016, 12(12).

标签: 病毒 STED 蛋白
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